免疫组化技术及常见问题分析

免疫组化技术及常见问题分析

免疫组织化学 (IHC) 是确定组织切片上是否存在蛋白及其位置的一种方法。尽管这种方法在定量分析时灵敏度较免疫印迹法或 ELISA 等免疫测定方法低，但它能了解整个组织的情况。适用于癌症等疾病发展及治疗情况的评估。因此，从 IHC 获得的信息结合显微技术提供了一副"宏图"，使来自其它方法的数据有据可依。

免疫组织化学染色是抗体识别目标抗原的过程。抗体具有高度特异性，只与组织切片上相应的蛋白抗原结合。应用显色检测法即能显示抗原-抗体反应，一种显色方法是酶结合抗体作为底物，在蛋白抗原位点产生色素沉着，另一种方法是荧光检测法，即将荧光染料结合到抗体上，应用荧光显微技术检测。

IHC-P 包括固定（通常在中性甲醛溶液中固定）、石蜡包埋、组织切片及染色。下面是IHC-P 的操作步骤：

1. 组织的固定和包埋

2. 切割并封固切片

3. 脱蜡至水

4. 抗原修复

5. 免疫组织化学染色

6. 复染（如果需要）

7. 脱水并用封固剂封固

8. 显微镜下观察染色

抗原修复

1. 热修复：枸橼酸钠 10 mM, pH 6.0

2. 热修复：Tris/EDTA pH 9.0

3. 酶解：胰蛋白酶、胃蛋白酶或其它蛋白酶。

抗原修复的最佳方法确定后，即可进行最佳抗体浓度的确定。

一抗浓度

对于已知的抗体浓度，我们建议试用 0.5 μg/ml 和 5 μg/ml 4 °C 过夜。对于未经纯化的一抗，我们建议使用下面的初始稀释度，也可以尝试 20 倍的更高的稀释度。

1. 全抗血清：1/50

2. 腹腔积液：1/100

3. 组织培养上清：不稀释

检测

我们建议使用辣根过氧化物酶 (HRP) 法，以过氧化物/DAB 作为底物和色素原，光学显微镜下观察。荧光显微镜法有多种荧光染料标记抗

体，具体用哪一种要根据试验需要选择。

固定

正确的固定是免疫组织化学法的关键。最常用的是 10% 中性甲醛溶液 (NBF)。Abcam 说明书推荐 IHC-P 使用该固定剂，另有说明的除外。

其它不常用的固定剂还有多聚甲醛 (PFA) 或 Bouin's 液（甲醛/苦味酸）等。这些固定剂的配方详见缓冲液部分，第 77 页。

理想的固定时间取决于组织切块的大小和类型。对于大多数组织来说，通常固定时间在 18-24 小时之间较为理想。固定不足可能导致组织

切片边缘有染色信号强，中间无信号。固定过度将会屏蔽抗原表位。虽然抗原修复有助于克服屏蔽作用，但如果固定时间太长（比如一周）

那么抗原修复也无济于事。

固定后，将组织块包埋于石蜡中，用切片机切成理想厚度（依据组织一般大约在 5-20 微米）的切片，然后将切片附着在玻片上。组织切

片最好封固在正电荷吸附或 3-氨基-丙酯-三-乙氧基-硅烷 (APES) 包被的玻片上，室温过夜，脱水并彻底干燥。如果切片不能很好的附着

在玻片上，可以将其与玻片共同置于 60 °C 孵育数小时。

脱蜡

染色前，切片必须先脱蜡至水。如果脱蜡不彻底，会使切片不易着色。

材料及试剂

二甲苯

无水乙醇

95% 乙醇

方法

将切片置于架子上，依据下列方法依次冲洗：

1. 二甲苯：2 X 3 分钟

2. 二甲苯与无水乙醇 1:1 混匀：3 分钟

3. 无水乙醇：2 X 3 分钟

4. 95% 乙醇：3 分钟

5. 70 %乙醇：3 分钟

6. 50 % 乙醇：3 分钟

7. 冷水流洗

 

常见问题分析

无染色

一抗和二抗不匹配

使用了针对一抗的二抗（如一抗来自兔，二抗为抗兔抗体）。

没有足够的一抗与目标蛋白结合

使用低稀释度抗体。延长 4 °C 孵育时间（如过夜）。

抗体的天然结构（3D 形态）受损不适用于 IHC

用天然（非变性的）WB 法检测抗体，确保抗体没被损坏。

不当储存、稀释或反复冻融造成一抗/二抗试剂盒失效

做阳性对照确认一抗/二抗试剂盒的有效性。

靶组织中没有目标蛋白

参照抗体供应商的建议做阳性对照。

组织中没有足够的目标蛋白

应用信号放大操作。

没有避光保存二抗

避免二抗处于光照下。

脱蜡不彻底

延长脱蜡时间，更换二甲苯。

固定步骤（用福尔马林或多聚甲醛固定）修饰了抗体识别表位

抗原修复法修复抗原表位，缩短固定时间。

蛋白位于细胞核内（核蛋白），抗体不能穿透核膜

在封闭液和抗体稀释液中加入通透剂。

PBS 缓冲液被细菌污染，破坏了目标蛋白的磷酸根

在抗体 PBS 储存液中加入 0.01% 叠氮化合物，或使用新鲜无菌的 PBS。

高背景

没有封闭非特异性结合或封闭不充分

延长封闭孵育周期时间，并考虑改换封闭剂。Abcam 建议用 10% 正常血清封闭切片 1 小时或 1-5% BSA 封闭培养细胞 30 分钟。

一抗浓度过高

滴定法寻找到最佳抗体浓度，或在浓度较低抗体中延长孵育时间(最好缓慢而准确结合)。

孵育温度过高

4 °C 孵育切片或细胞。

二抗发生了非特异性结合（被损坏）

不加一抗，做二抗对照。

组织冲洗不彻底，有固定剂残留

所有步骤都要用 PBS 充分洗涤。

存在内源性过氧化物酶活性

用酶抑制剂如抑制碱性磷酸酶的盐酸左旋咪唑 (2 mM)，或抑制过氧化物酶的 H2O2 (0.3% v/v)。（详见 IHC 说明书）。

固定步骤反应强烈（固定剂用福尔马林和多聚甲醛）导致抗体识别位点被修饰

改变抗原修复方法，缩短与抗原修复液的孵育时间。

信号过度放大（信号放大技术）

缩短信号放大孵育时间，稀释信号扩大试剂盒。

底物过量（酶检测法）

缩短底物孵育时间。

染料与 PBS 在细胞/组织中相互作用（酶检测法）

用 Tris 缓冲液冲洗切片后，再与底物孵育。然后，Tris 缓冲液再次冲洗细胞/切片。

通透作用破坏膜并除去膜蛋白

去除缓冲液中的通透剂。

非特异性染色

一抗/二抗浓度过高

降低抗体浓度和/或缩短孵育时间。对比不表达目标蛋白细胞的信号强度。

存在内源性过氧化物酶活性

用酶抑制剂如抑制碱性磷酸酶的盐酸左旋咪唑 (2 mM)，或抑制过氧化物酶的 H2O2 (0.3% v/v)。（详见 IHC 说明书）。

一抗与被染组织同源（如用鼠一抗测鼠组织），二抗与同源的所有组织结合

应用与组织非同源的一抗。

切片/细胞变干

保持切片/细胞湿度，切勿变干。